Smitteforsøk for å forstå sykdomsutvikling i infeksiøs lakseanemi
1 Formål
I. Etablere velutprøvd protokoll for badesmitte med infeksiøs lakseanemivirus (ILAV) i akvariet på NMBU.
II. Forstå samspillet mellom ILAV og forskjellige celletyper i laks og dets betydning på sykdomsutvikling og infeksjonsforløp.
2 Skadevirkninger
Forsøket anses som betydelig belastende, da en andel av virusinfisert fisk forventes å utvikle alvorlig sykdom og død.
3 Forventet nytteverdi
Infeksiøs lakseanemi er en svært alvorlig og listeført sykdom hos oppdrettslaks som medfører store økonomiske tap for norsk oppdrettsnæring. Forekomsten har økt kraftig i 2020 og 2021, og det er et stort behov for å forstå hvordan vi skal kontrollere og hindre spredning av infeksjonen, herunder hvordan viruset reagerer med og infiserer forskjellige celletyper, som vi undersøker her. Forsøkene vil i tillegg gi økt generell kunnskap om virus-verts interaksjoner.
4 Antall dyr og art
273 individer, Atlantisk laks (Salmo salar).
5 Hvordan etterleve 3R
Erstatte (Replace): Vi bruker i stor grad fiskecellelinjer og celler og vev fra frisk fisk (FOTSID 24382) for å erstatte smitteforsøk i levende fisk. Vi analyserer også arkivmateriale fra tidligere smitteforsøk. Nye smitteforsøk brukes kun når dette ikke kan gi oss svarene vi trenger, som når vi skal kartlegge den spesifikke responsen i forskjellige celletyper ved hjelp av enkeltcellesekvensering og er avhengig av ferskt vev fra infisert fisk. Etterprøving av funn gjøres ved hjelp av analyser av arkivmateriale fra naturlige utbrudd og tidligere smitteforsøk. Dette reduserer antallet fisk som brukes. Materialet fra forsøket vi søker om her, vil for øvrig inngå i dette arkivmaterialet for fremtidig bruk.
Redusere: Vi reduserer antallet fisk som brukes ved å kombinere to prosjekter som begge krever nye smitteforsøk. Dermed kan begge prosjektene hente ut (forskjellige) prøver fra samme individer og færre dyr brukes totalt. Dette gjør også at vi kan se resultatene fra de to prosjektene i sammenheng og gir større utbytte enn om forsøkene ble gjort separat. Bruk av badesmitte som modell reduserer dessuten både det totale antallet fisk samt varigheten for hvert individ i forhold til kohabitasjonsmodellen, som ville kreve en ekstra gruppe fisk som ble infisert ved injeksjon og deretter smittet de andre i en mer langtrukken prosess. Vi understreker at enkelte problemstillinger kan gjøre det nødvendig å bruke kohabitasjonsmodellen, som vi ikke er prinsipielt i mot, men for å besvare spørsmålene vi stiller, er badesmitte bedre egnet.
Raffinere: Smittemodellen vi bruker er utviklet av forskere med lang erfaring med denne typen forsøk. Vi bruker badesmitte som har flere fordeler: 1) fisken infiseres på en måte som gjenspeiler naturlig smitte (i forhold til injeksjonssmitte), 2) prosessen er koordinert (i forhold til kohabitasjonssmitte), 3) vi reduserer håndteringen (evt. anestesi) av fisken ved smitte, siden viruset tilsettes vannet. Smitteforsøk med ILAV utføres ofte med dødelighet som viktigste parameter. Også vi bruker dødelighet som et humant endepunkt. Vi har imidlertid sett at mange infeksjonsparametere oppfører seg likt selv ved lav dødelighet og ønsker i større grad å utnytte dette for å redusere belastningen på fisken. Informasjonen vi innhenter i disse forsøkene vil derfor hjelpe oss med å underbygge videre raffinering av fremtidige forsøk.
I. Etablere velutprøvd protokoll for badesmitte med infeksiøs lakseanemivirus (ILAV) i akvariet på NMBU.
II. Forstå samspillet mellom ILAV og forskjellige celletyper i laks og dets betydning på sykdomsutvikling og infeksjonsforløp.
2 Skadevirkninger
Forsøket anses som betydelig belastende, da en andel av virusinfisert fisk forventes å utvikle alvorlig sykdom og død.
3 Forventet nytteverdi
Infeksiøs lakseanemi er en svært alvorlig og listeført sykdom hos oppdrettslaks som medfører store økonomiske tap for norsk oppdrettsnæring. Forekomsten har økt kraftig i 2020 og 2021, og det er et stort behov for å forstå hvordan vi skal kontrollere og hindre spredning av infeksjonen, herunder hvordan viruset reagerer med og infiserer forskjellige celletyper, som vi undersøker her. Forsøkene vil i tillegg gi økt generell kunnskap om virus-verts interaksjoner.
4 Antall dyr og art
273 individer, Atlantisk laks (Salmo salar).
5 Hvordan etterleve 3R
Erstatte (Replace): Vi bruker i stor grad fiskecellelinjer og celler og vev fra frisk fisk (FOTSID 24382) for å erstatte smitteforsøk i levende fisk. Vi analyserer også arkivmateriale fra tidligere smitteforsøk. Nye smitteforsøk brukes kun når dette ikke kan gi oss svarene vi trenger, som når vi skal kartlegge den spesifikke responsen i forskjellige celletyper ved hjelp av enkeltcellesekvensering og er avhengig av ferskt vev fra infisert fisk. Etterprøving av funn gjøres ved hjelp av analyser av arkivmateriale fra naturlige utbrudd og tidligere smitteforsøk. Dette reduserer antallet fisk som brukes. Materialet fra forsøket vi søker om her, vil for øvrig inngå i dette arkivmaterialet for fremtidig bruk.
Redusere: Vi reduserer antallet fisk som brukes ved å kombinere to prosjekter som begge krever nye smitteforsøk. Dermed kan begge prosjektene hente ut (forskjellige) prøver fra samme individer og færre dyr brukes totalt. Dette gjør også at vi kan se resultatene fra de to prosjektene i sammenheng og gir større utbytte enn om forsøkene ble gjort separat. Bruk av badesmitte som modell reduserer dessuten både det totale antallet fisk samt varigheten for hvert individ i forhold til kohabitasjonsmodellen, som ville kreve en ekstra gruppe fisk som ble infisert ved injeksjon og deretter smittet de andre i en mer langtrukken prosess. Vi understreker at enkelte problemstillinger kan gjøre det nødvendig å bruke kohabitasjonsmodellen, som vi ikke er prinsipielt i mot, men for å besvare spørsmålene vi stiller, er badesmitte bedre egnet.
Raffinere: Smittemodellen vi bruker er utviklet av forskere med lang erfaring med denne typen forsøk. Vi bruker badesmitte som har flere fordeler: 1) fisken infiseres på en måte som gjenspeiler naturlig smitte (i forhold til injeksjonssmitte), 2) prosessen er koordinert (i forhold til kohabitasjonssmitte), 3) vi reduserer håndteringen (evt. anestesi) av fisken ved smitte, siden viruset tilsettes vannet. Smitteforsøk med ILAV utføres ofte med dødelighet som viktigste parameter. Også vi bruker dødelighet som et humant endepunkt. Vi har imidlertid sett at mange infeksjonsparametere oppfører seg likt selv ved lav dødelighet og ønsker i større grad å utnytte dette for å redusere belastningen på fisken. Informasjonen vi innhenter i disse forsøkene vil derfor hjelpe oss med å underbygge videre raffinering av fremtidige forsøk.
Begrunnelse for etterevalueringen
Mattilsynet er forpliktet etter regelverket til å etterevaluere alle forsøk som er betydelig belastende for forsøksdyrene.
Etterevaluering
• Forsøket har latt oss etablere en vellykket ILAV badesmittemodell i det nye smitteakvariet ved NMBU og med fisk klekket på NMBU. Forsøket har også gitt ny kunnskap om samspillet mellom ILAV og forskjellige typer lakseceller. I tillegg til resultatene som publiseres som artikler, har arbeidet resultert i to datasett som til sammen viser genuttrykket i ca 100,000 individuelle celler og illusterer hvordan forskjellige celletyper reagerer på ILAV infeksjon. Datasettene vil gjøres offentlig tilgjengelige når artiklene publiseres, for å fremme gjenbruk, i tråd med 3R.
En utfordring med ILA er at vi ikke fullt ut forstår faktorene som styrer hvor mottakelig laksen er for å bli syk. Denne fisken var svært mottagelig, og vi avsluttet forsøket 18 dager etter infeksjon, ved det humane endepunktet for dødelighet (40%). Maks. virusnivåer i blodet ble målt dag 14. Det første dødsfallet skjedde på dag 15 med tydelige tegn på viral sepsis (blødninger, ascites). Slike tegn ble sett i flere av den prøvetatte fisken dag 16 og 18, mens andre fisk ikke viste tegn på tross av lignende virusnivåer.
Noen hadde også blødninger på finnerot og i øye, men dette var vanskelig å se før fisken ble tatt opp av tanken. Det var som forventet vanskelig å fange opp syk fisk før den var nærmest døende. Det mest pålitelige tegnet på alvorlig sykdom var et fargeskifte langs ryggen, men dette kom sent og var til liten hjelp for å plukke ut syk fisk. Ingen endringer av svømmemønster eller balanse ble observert.
Det antas at en del av den infiserte fisken har opplevd viral sepsis og betydelig ubehag. Varigheten for hver enkelt fisk er ikke kjent, men perioden antas å være mellom dag 15 og 18.
• Forsøket har vært betydelig belastende.
• På tross av nøye observasjon er det vanskelig å plukke ut syk fisk fra tanken.
• Viral sepsis og død utviklet seg fra dag 15. Forsøket ble avsluttet på dag 18 da det humane endepunktet på 40% dødelighet ble møtt.
• Hyppige prøvetakinger i pilotforsøket har gitt oss grunnlag for å identifisere forskjellige milepæler i infeksjonsforløpet, som gjør det lettere å ta prøver på riktig tidspunkt. For eksempel gjør vi flow cytometri etter hver prøvetaking, som gjør det mulig å måle virus på røde blodceller og gi et løpende mål på hvor langt infeksjonen har kommet. Dette gir mer presis prøvetaking, og kan i noen tilfeller gjøre det mulig å redusere antall prøvetakingstidspunkt.
En utfordring med ILA er at vi ikke fullt ut forstår faktorene som styrer hvor mottakelig laksen er for å bli syk. Denne fisken var svært mottagelig, og vi avsluttet forsøket 18 dager etter infeksjon, ved det humane endepunktet for dødelighet (40%). Maks. virusnivåer i blodet ble målt dag 14. Det første dødsfallet skjedde på dag 15 med tydelige tegn på viral sepsis (blødninger, ascites). Slike tegn ble sett i flere av den prøvetatte fisken dag 16 og 18, mens andre fisk ikke viste tegn på tross av lignende virusnivåer.
Noen hadde også blødninger på finnerot og i øye, men dette var vanskelig å se før fisken ble tatt opp av tanken. Det var som forventet vanskelig å fange opp syk fisk før den var nærmest døende. Det mest pålitelige tegnet på alvorlig sykdom var et fargeskifte langs ryggen, men dette kom sent og var til liten hjelp for å plukke ut syk fisk. Ingen endringer av svømmemønster eller balanse ble observert.
Det antas at en del av den infiserte fisken har opplevd viral sepsis og betydelig ubehag. Varigheten for hver enkelt fisk er ikke kjent, men perioden antas å være mellom dag 15 og 18.
• Forsøket har vært betydelig belastende.
• På tross av nøye observasjon er det vanskelig å plukke ut syk fisk fra tanken.
• Viral sepsis og død utviklet seg fra dag 15. Forsøket ble avsluttet på dag 18 da det humane endepunktet på 40% dødelighet ble møtt.
• Hyppige prøvetakinger i pilotforsøket har gitt oss grunnlag for å identifisere forskjellige milepæler i infeksjonsforløpet, som gjør det lettere å ta prøver på riktig tidspunkt. For eksempel gjør vi flow cytometri etter hver prøvetaking, som gjør det mulig å måle virus på røde blodceller og gi et løpende mål på hvor langt infeksjonen har kommet. Dette gir mer presis prøvetaking, og kan i noen tilfeller gjøre det mulig å redusere antall prøvetakingstidspunkt.