Single and combined role of complement component C3 and the TLR co-receptor CD14 in acute stroke in a mice model.
1 Purpose
Hypothesis: Two central upstream molecules in the complement and TLR system, i.e. C3 and CD14, together contribute to the tissue damage in cerebral stroke.
Complement is a pattern recognition system, specialized to recognize and destruct invading microorganisms (pattern associated molecular patterns; PAMPs) and injured cells (damage associated molecular patterns; DAMPs). PAMPs and DAMPs bind to pattern recognition molecules (PRM), including various complement molecules. The complement system is essential for tissue homeostasis and normally subjected to strict regulation. However, improper or excessive activation significantly contributes to tissue damage.
Toll-like receptors (TLRs) system is a pattern recognition system. It's upregulated when PAMPs and DAMPs are recognized by the TLRs. TLRs are dependent on co-factors for their signaling function. CD14 plays a key role in a number of these signaling pathways and has been shown to be a co-receptor for several of the TLRs. This situates CD14 as an utmost interesting molecule for innate immunity recognition, and thus as a promising target, attenuating TLR-induced inflammation.
Acute ischemia-reperfusion injury are fundamental for the pathophysiology leading to diseases, including trauma, infarctions like stroke, sepsis, burns and transplant rejection. The common denominator in these conditions is activation of pattern recognition receptors by PAMPs and DAMPs. Thus, the host recognition system is the “upstream” sensor and responsible for further signaling in order to protect the host. Since the mechanism of sensing and activation via PRR is principally similar independent of the DAMPs, we argue that the upstream dual inhibition is a universal treatment approach for these conditions. We intend to test this hypothesis in the present protocol using a cerebral stoke model in C3 and CD14 single and double knockout mice.
2 Distress
The mice will in a time course of 30 minutes be anesthetized twice the first time to place and thereafter to remove a filament that will block the middle cerebral artery. The mice will primarily experience distress from the surgery and also the body’s reaction to the blockade of the middle cerebral artery. Mice will be monitored closely after placement and removal of the filament, regarding pain/discomfort. Overall, the distress can be severe.
3 Expected utility
If successful, a possible translation to humans might have important consequences for, treatment of patients with stroke, healthcare and the society.
4 Number of animals and species
For this experiment, our experimental setup requires a total of 96 mice of 4 different genotypes.
5 How to comply the 3Rs
1) Replacement. The project will use the animal species with the lowest neurologic development, but still consistent with the aims of the research. No alternative methods offer the same immunological complexity of the animal model, and therefore cannot be reasonably used in this research.
2) Reduction. The number of the animal used will be as lower as possible by a pre hoc calculation of the sample size.
3) Refinement. The methods applied for the induction of focal ischemia is optimized to reduce animal suffering. All behavioral and biochemical analysis are optimized to yield solid and unbiased data.
Hypothesis: Two central upstream molecules in the complement and TLR system, i.e. C3 and CD14, together contribute to the tissue damage in cerebral stroke.
Complement is a pattern recognition system, specialized to recognize and destruct invading microorganisms (pattern associated molecular patterns; PAMPs) and injured cells (damage associated molecular patterns; DAMPs). PAMPs and DAMPs bind to pattern recognition molecules (PRM), including various complement molecules. The complement system is essential for tissue homeostasis and normally subjected to strict regulation. However, improper or excessive activation significantly contributes to tissue damage.
Toll-like receptors (TLRs) system is a pattern recognition system. It's upregulated when PAMPs and DAMPs are recognized by the TLRs. TLRs are dependent on co-factors for their signaling function. CD14 plays a key role in a number of these signaling pathways and has been shown to be a co-receptor for several of the TLRs. This situates CD14 as an utmost interesting molecule for innate immunity recognition, and thus as a promising target, attenuating TLR-induced inflammation.
Acute ischemia-reperfusion injury are fundamental for the pathophysiology leading to diseases, including trauma, infarctions like stroke, sepsis, burns and transplant rejection. The common denominator in these conditions is activation of pattern recognition receptors by PAMPs and DAMPs. Thus, the host recognition system is the “upstream” sensor and responsible for further signaling in order to protect the host. Since the mechanism of sensing and activation via PRR is principally similar independent of the DAMPs, we argue that the upstream dual inhibition is a universal treatment approach for these conditions. We intend to test this hypothesis in the present protocol using a cerebral stoke model in C3 and CD14 single and double knockout mice.
2 Distress
The mice will in a time course of 30 minutes be anesthetized twice the first time to place and thereafter to remove a filament that will block the middle cerebral artery. The mice will primarily experience distress from the surgery and also the body’s reaction to the blockade of the middle cerebral artery. Mice will be monitored closely after placement and removal of the filament, regarding pain/discomfort. Overall, the distress can be severe.
3 Expected utility
If successful, a possible translation to humans might have important consequences for, treatment of patients with stroke, healthcare and the society.
4 Number of animals and species
For this experiment, our experimental setup requires a total of 96 mice of 4 different genotypes.
5 How to comply the 3Rs
1) Replacement. The project will use the animal species with the lowest neurologic development, but still consistent with the aims of the research. No alternative methods offer the same immunological complexity of the animal model, and therefore cannot be reasonably used in this research.
2) Reduction. The number of the animal used will be as lower as possible by a pre hoc calculation of the sample size.
3) Refinement. The methods applied for the induction of focal ischemia is optimized to reduce animal suffering. All behavioral and biochemical analysis are optimized to yield solid and unbiased data.
Etterevaluering
The Norwegian Food Safety Authority must retrospectively assess all severe experiments. You are therefore required to submit necessary information making it possible for us to evaluate 1) whether the objectives of the project were achieved, 2) the harm inflicted on the animals, and 3) any elements that may contribute to further implementation of 3 R in future studies. This information must be submitted via FOTS.
Begrunnelse for etterevalueringen
Formålet med dette forsøksprosjektet har vært å teste hypotesen om at to sentrale oppstrøms-molekyler i komplement- og TLR-systemet, C3 og CD14, sammen bidrar til vevsskade ved hjerneslag.
Kan inflammasjonsresponsen ved hjerneslag hos mus reduseres ved å blokkere komplement eller TLR?
Hypotesen er blitt testet i en hjerneslagmodell med C3 og CD14 enkel- og dobbel- knockout-mus.
Forsøkene ble utført fra 12. til 23. september 2022. Operasjonen av musene var vellykket for flertallet av musene. Basert på inklusjonskriteriene ble 3 mus (4,3%) ekskludert fra studien, da filamentet ikke var rett plassert i den midtre cerebrale arterien.
En del av musene ble avlivet da de nådde humant endepunkt, de resterende musene ble vurdert ved å bruke scorearket for nevrologiske utfall, hvorav resultatene er hovedresultatet av studien.
Deretter ble musene avlivet og hjerner ble isolert.
68 dyr gjennomgikk full protokoll med kirurgi, og er rapportert i belastningskategorien betydelig. Ett dyr døde under operasjon og 3 dyr måtte erstattes p.g.a. inklusjonskriterier. 15 dyr ble benyttet til kartlegging av hjernene og hadde ingen belastning siden de ble avlivet uten å gjennomgå noen prosedyre. Disse 15 musene er rapportert i belastningskategorien mild.
Forsøksansvarlig angir at forskergruppen våren 2023 arbeider med de isolerte hjernene for å visualisere infarktstørrelsen og flere komplement- og immunrelaterte markører.
Gjennomføringen av forsøket var vellykket, og dataene vil bli publisert uavhengig av positive eller negative funn om rollen til komplement og CD14 i hjerneslag.
Dataene vil gi et innblikk i det medfødte immunforsvarets rolle i hjerneslag både på systemisk og lokalt nivå. Dette kan være nyttig for klinikere frem i tid for å kunne gi en mer effektiv behandling av hjerneslagpasienter.
Musene ble nøye observert i løpet av de 48 timene studien varte. Noen av musene trengte mer analgesi i løpet av de siste 24 timene med observasjon.
Ingen mus ble avlivet i løpet av de første 24 timene, men flere ble avlivet 25-48 etter operasjonen.
Gjennomsnittlig helsepoengsum for de avlivede musene var 9. Ingen mus ble avlivet på grunn av å ha nådd en poengsum på 13 eller høyere på helseovervåkingsskalaen, som var grensen for avlivning. Alle de 10 musene som ble avlivet før observasjonsslutt, nådde humant endepunkt på kroppsvektparameteren (15 % vekttap). To av disse nådde også humant endepunkt på atferdsparameteret ('Ingen aktivitet og reagerer ikke på stimulering'). En mus nådde også humant endepunkt på bevegelsesparameteret ('Kan ikke bevege seg og reagerer ikke på stimuli').
Beregningen av antall dyr som var nødvendig for å gjennomføre forsøkene var gjort med utgangspunkt i en iskemitid på 60 minutter. Denne ble i løpet av forsøksperioden redusert fra 60 til 30 minutter, noe som reduserte behovet for erstatningsdyr.
Selve den kirurgiske delen av forsøket er det lite forbedringspotensiale ved. Her er et av de viktigste punktene en erfaren kirurg. Dyrene har fått god smertebehandling, og de ble observert døgnet rundt.
Basert på erfaringene fra forsøket foreslår forskergruppen for lignende forsøk å evaluere graden av dehydrering og gi væskebehandling ved subkutan injeksjon av kroppsvarmt Ringer-acetat til dehydrerte dyr.
Dette bør gjøres på en standardisert måte, en bestemt % av kroppsvekten bør administreres til alle dyr. Vanligvis er påvisning av dehydrering under 5-10 % av kroppsvekten vanskelig, derfor vil et fastsatt volum (f.eks. 5 % av kroppsvekten) per dag i kritisk fase være en måte å forbedre dyrevelferden på.
Forsøksansvarlig angir at punktet i scoreskjemaet om fôrinntak er vanskelig å evaluere i et bur med flere individer. Dette parameteret vil gjenspeiles i vekttapet til musene, og kunne vært droppet som selvstendig parameter i denne studien.
Maksimalt vekttap og et av de humane endepunktene i denne studien var 15%.
Forsøksansvarlig angir at noen av musene ble avlivet på grunn av et 15% vekttap, uten andre alvorlige kliniske tegn.
Forsøksmedarbeiderne observerte at noen av musene gikk opp igjen i vekt etter et vekttap som nærmet seg 15%, noe som indikerer at det maksimale vekttapet i studien kanskje burde ha vært satt til 20%.
Musene som ble avlivet på grunn av vekttap som eneste alvorlige kliniske tegn kunne da ha bidratt med verdifulle data i forsøket.
For denne typen undersøkelser av hjerneslag og betydningen av immunforsvaret er det nødvendig å bruke forsøksdyr.
Beregningen av gruppestørrelser og nødvendig antall dyr var riktig med de humane endepunkter som var bestemt og med utgangspunkt i en iskemitid på 60 minutter.
Forsøket er raffinert i løpet av forsøksperioden ved å redusere iskemitiden fra 60 til 30 minutter.
Kan inflammasjonsresponsen ved hjerneslag hos mus reduseres ved å blokkere komplement eller TLR?
Hypotesen er blitt testet i en hjerneslagmodell med C3 og CD14 enkel- og dobbel- knockout-mus.
Forsøkene ble utført fra 12. til 23. september 2022. Operasjonen av musene var vellykket for flertallet av musene. Basert på inklusjonskriteriene ble 3 mus (4,3%) ekskludert fra studien, da filamentet ikke var rett plassert i den midtre cerebrale arterien.
En del av musene ble avlivet da de nådde humant endepunkt, de resterende musene ble vurdert ved å bruke scorearket for nevrologiske utfall, hvorav resultatene er hovedresultatet av studien.
Deretter ble musene avlivet og hjerner ble isolert.
68 dyr gjennomgikk full protokoll med kirurgi, og er rapportert i belastningskategorien betydelig. Ett dyr døde under operasjon og 3 dyr måtte erstattes p.g.a. inklusjonskriterier. 15 dyr ble benyttet til kartlegging av hjernene og hadde ingen belastning siden de ble avlivet uten å gjennomgå noen prosedyre. Disse 15 musene er rapportert i belastningskategorien mild.
Forsøksansvarlig angir at forskergruppen våren 2023 arbeider med de isolerte hjernene for å visualisere infarktstørrelsen og flere komplement- og immunrelaterte markører.
Gjennomføringen av forsøket var vellykket, og dataene vil bli publisert uavhengig av positive eller negative funn om rollen til komplement og CD14 i hjerneslag.
Dataene vil gi et innblikk i det medfødte immunforsvarets rolle i hjerneslag både på systemisk og lokalt nivå. Dette kan være nyttig for klinikere frem i tid for å kunne gi en mer effektiv behandling av hjerneslagpasienter.
Musene ble nøye observert i løpet av de 48 timene studien varte. Noen av musene trengte mer analgesi i løpet av de siste 24 timene med observasjon.
Ingen mus ble avlivet i løpet av de første 24 timene, men flere ble avlivet 25-48 etter operasjonen.
Gjennomsnittlig helsepoengsum for de avlivede musene var 9. Ingen mus ble avlivet på grunn av å ha nådd en poengsum på 13 eller høyere på helseovervåkingsskalaen, som var grensen for avlivning. Alle de 10 musene som ble avlivet før observasjonsslutt, nådde humant endepunkt på kroppsvektparameteren (15 % vekttap). To av disse nådde også humant endepunkt på atferdsparameteret ('Ingen aktivitet og reagerer ikke på stimulering'). En mus nådde også humant endepunkt på bevegelsesparameteret ('Kan ikke bevege seg og reagerer ikke på stimuli').
Beregningen av antall dyr som var nødvendig for å gjennomføre forsøkene var gjort med utgangspunkt i en iskemitid på 60 minutter. Denne ble i løpet av forsøksperioden redusert fra 60 til 30 minutter, noe som reduserte behovet for erstatningsdyr.
Selve den kirurgiske delen av forsøket er det lite forbedringspotensiale ved. Her er et av de viktigste punktene en erfaren kirurg. Dyrene har fått god smertebehandling, og de ble observert døgnet rundt.
Basert på erfaringene fra forsøket foreslår forskergruppen for lignende forsøk å evaluere graden av dehydrering og gi væskebehandling ved subkutan injeksjon av kroppsvarmt Ringer-acetat til dehydrerte dyr.
Dette bør gjøres på en standardisert måte, en bestemt % av kroppsvekten bør administreres til alle dyr. Vanligvis er påvisning av dehydrering under 5-10 % av kroppsvekten vanskelig, derfor vil et fastsatt volum (f.eks. 5 % av kroppsvekten) per dag i kritisk fase være en måte å forbedre dyrevelferden på.
Forsøksansvarlig angir at punktet i scoreskjemaet om fôrinntak er vanskelig å evaluere i et bur med flere individer. Dette parameteret vil gjenspeiles i vekttapet til musene, og kunne vært droppet som selvstendig parameter i denne studien.
Maksimalt vekttap og et av de humane endepunktene i denne studien var 15%.
Forsøksansvarlig angir at noen av musene ble avlivet på grunn av et 15% vekttap, uten andre alvorlige kliniske tegn.
Forsøksmedarbeiderne observerte at noen av musene gikk opp igjen i vekt etter et vekttap som nærmet seg 15%, noe som indikerer at det maksimale vekttapet i studien kanskje burde ha vært satt til 20%.
Musene som ble avlivet på grunn av vekttap som eneste alvorlige kliniske tegn kunne da ha bidratt med verdifulle data i forsøket.
For denne typen undersøkelser av hjerneslag og betydningen av immunforsvaret er det nødvendig å bruke forsøksdyr.
Beregningen av gruppestørrelser og nødvendig antall dyr var riktig med de humane endepunkter som var bestemt og med utgangspunkt i en iskemitid på 60 minutter.
Forsøket er raffinert i løpet av forsøksperioden ved å redusere iskemitiden fra 60 til 30 minutter.