Immunisation, challenge and scRNAseq of cod
Vibrio anguillarum is the causative agent of a fatal haemorrhagic septicaemia and a commonly encountered disease in unvaccinated cold-water fish species such as Atlantic cod and salmon. Atlantic cod has a highly unusual immune system due to loss of Major Histocompatibility Complex (MHC) class II, normally used by antigen-presenting cells to activate CD4-positive T cells. CD4 is also lost in cod. Because of this defect, cod have poor and variable antibody responses. Nevertheless, protective immunity against vibriosis can be achieved by immunization, but unlike in salmon, immunity does not correlate with antibody responses. This study will attempt to identify immune-response signatures in Atlantic cod that correlate with protective immunity. Such information is vital to develop vaccines against other bacterial and viral disease in this species. Cod will be immunized by bath immersion in formalin-fixed whole cell Vibrio bacteria, followed by one additional booster bath immunization. Eight weeks after the last immunization, immune and non-vaccinated fish will be challenged with V. anguillarum, both the strain that was used for vaccination and an antigenically different strain of V. anguillarum to test the specificity of the immune response. Appropriate controls to document vaccine efficacy and specificity will be included. Prior to infection of naïve and immune fish, a small-scale study to determine optimal infectious dose (LD50) for this fish cohort will be performed. A small number of fish (3 fish per group per time point) will be sampled immediately before and on day 7 after each vaccination, as well as immediately before and on day 1 and day 4 after challenge with either of the two V. anguillarum strains. We plan to sample 30 fish in total. At all sampling times, fish will be euthanized by a quick blow to the head followed by dislocation of the cervical vertebra. Blood samples will be collected for evaluation of antibody response, and spleen will be collected for bacterial culture as well as analysis of the immune response by single-cell transcriptomics. We will assess the long-term protective effect of vibrio vaccination by challenging the fish one year after last vaccination. We will also evaluate the protective effect of serum antibodies from vaccinated fish by doing serum transfer experiments followed by infectious challenge, together with a side arm where the in vivo half life of transferred labelled IgG will be assessed. The total number of animals used in the experiment is 531. Humane endpoints will be used for any fish that shows signs of disease or abnormal behaviour (lethargy, bloating, disoriented swimming).
Etterevaluering
Mattilsynet er forpliktet etter regelverket til å etterevaluere alle forsøk som er betydelig belastende for forsøksdyra.
Begrunnelse for etterevalueringen
Forsøket ble gjennomført ved NIVAs forskningsstasjon Solbergstand av en forskergruppe med deltakere fra Universitetet i Oslo og Universitetet for miljø og biovitenskap. Det ble etablert en protokoll for smitteforsøk med Vibrio anguillarum og en protokoll for vaksinasjon av torsk mot bakterien. Det ble i tillegg påvist at laks utvikler en spesifikk immunitet etter vaksinasjon og at denne varer i minst 12 måneder. Videre ble det dokumentert at serumoverføring gir beskyttelse og at torsk har et stort CD8-negativt T-cellekompleks.
Det ble benyttet totalt 385 torsk i forsøket. Av disse ble 12 benyttet i forbindelse med prøveuttak før forsøket startet (0-prøve) og 9 døde av naturlige årsaker som ikke var relatert til forsøket.
I alt 244 av de 368 torskene som ble brukt i smitteforsøk ble klassifisert som betydelig belastet. I titreringseksperiment døde 56 fisk av 132 i løpet av den 15 dager lange oppfølgingstiden. Dødeligheten i de ulike gruppene varierte fra 5 % til 82 %. I hovedforsøket døde 40 av 162 fisk på grunn av infeksjonen og dødeligheten i de forskjellige gruppene varierte fra 0 til 56 %. I serumoverføringsforsøket døde 9 av 40 fisk og dødeligheten var 18 til 40 %. I det siste forsøket som ble gjennomført 12 måneder etter vaksinasjon, døde 7 av 30 fisk av infeksjonen og dødeligheten var 15 til 40 %. Av torskene som overlevde 15 dager etter infeksjonsstart, hadde mange tegn på infeksjon, inkludert hudblødninger, sår og eksoftalmi.
Det opplyses om at 10 dyr ble tatt ut av forsøket og avlivet fordi de hadde oppnådd et humant endepunkt. Disse er inkludert i antallet døde i det enkelte forsøket.
Forskerne opplyser at de har benyttet det laveste antall fisk i hver gruppe og oppnådde akkurat nok forskjell i dødelighet til å nå statistisk signifikans i hovedforsøket og 12 måneders forsøket etter vaksinasjon. I serumoverføringsforsøket ble imidlertid gruppestørrelsen på 16 individer for liten til å oppnå statistisk signifikans. Årsaken til dette var mangel på immunserum.
Resultatene fra dette prosjektet kan benyttes videre i arbeidet med at nå forskergruppens endelige mål som er å få detaljert kunnskap om immunresponsen hos torsk etter smitte med denne vibriobakterien og etter vaksinasjon mot vibriose. Med slik kunnskap kan man kanskje oppdage en spesifikk biologisk parameter som kan forutsi om torsk vil overleve eller dø av en infeksjon med bakterien. En slik oppdagelse kan medføre at man i fremtiden kan bruke lavere bakteriedose slik at det blir mulig å studere immunrespons uten at dyrene dør av infeksjonen.
Det ble benyttet totalt 385 torsk i forsøket. Av disse ble 12 benyttet i forbindelse med prøveuttak før forsøket startet (0-prøve) og 9 døde av naturlige årsaker som ikke var relatert til forsøket.
I alt 244 av de 368 torskene som ble brukt i smitteforsøk ble klassifisert som betydelig belastet. I titreringseksperiment døde 56 fisk av 132 i løpet av den 15 dager lange oppfølgingstiden. Dødeligheten i de ulike gruppene varierte fra 5 % til 82 %. I hovedforsøket døde 40 av 162 fisk på grunn av infeksjonen og dødeligheten i de forskjellige gruppene varierte fra 0 til 56 %. I serumoverføringsforsøket døde 9 av 40 fisk og dødeligheten var 18 til 40 %. I det siste forsøket som ble gjennomført 12 måneder etter vaksinasjon, døde 7 av 30 fisk av infeksjonen og dødeligheten var 15 til 40 %. Av torskene som overlevde 15 dager etter infeksjonsstart, hadde mange tegn på infeksjon, inkludert hudblødninger, sår og eksoftalmi.
Det opplyses om at 10 dyr ble tatt ut av forsøket og avlivet fordi de hadde oppnådd et humant endepunkt. Disse er inkludert i antallet døde i det enkelte forsøket.
Forskerne opplyser at de har benyttet det laveste antall fisk i hver gruppe og oppnådde akkurat nok forskjell i dødelighet til å nå statistisk signifikans i hovedforsøket og 12 måneders forsøket etter vaksinasjon. I serumoverføringsforsøket ble imidlertid gruppestørrelsen på 16 individer for liten til å oppnå statistisk signifikans. Årsaken til dette var mangel på immunserum.
Resultatene fra dette prosjektet kan benyttes videre i arbeidet med at nå forskergruppens endelige mål som er å få detaljert kunnskap om immunresponsen hos torsk etter smitte med denne vibriobakterien og etter vaksinasjon mot vibriose. Med slik kunnskap kan man kanskje oppdage en spesifikk biologisk parameter som kan forutsi om torsk vil overleve eller dø av en infeksjon med bakterien. En slik oppdagelse kan medføre at man i fremtiden kan bruke lavere bakteriedose slik at det blir mulig å studere immunrespons uten at dyrene dør av infeksjonen.