In vivo testing of salmon gene knockouts and genetic virus attenuation
Main goals:
1) To develop a better standardized and more reproducible system for experiments with live fish. Many of today’s fish experiments are performed with a genetically variable fish material and/or the few times a year when genetically homogenous fish are available at the desired size. Our (longer-term) purpose is to develop a system where the same fish strain, isolate or even clone can be used year-round. All else equal, this will increase the direct comparability between experiments and hence maximize the scientific value of each of them.
2) To test our experimentally based hypothesis that a variant of a specific innate immune gene is of importance for resistance to virus infection in nature. We have used CRISPR to knock out the gene and will use an experimental SAV challenge to compare knock-outs with wild type salmon.
3) To test if our genetically attenuated virus clones are indeed attenuated when introduced to fish. We have used in vitro experiments to verify attenuation in cell cultures, but virus infections work at an organismal level that cannot satisfactorily be simulated by cell lines. The attenuated virus will be a valuable reagent for understanding virus infection and host-pathogen interactions in general and hold considerable potential as a vaccine candidate against a severe viral disease.
4) To establish a standardized viral challenge model where virus clones (infectious plasmid constructs) will form the backbone of a highly consistent experimental system. Infectious plasmid constructs can easily be quantified, does not change as result of cell propagation and remain invariable over time – which all contribute to more a standardized challenge model and hence more comparable future experiments.
The application includes three separate pilot/small scale trials:
Trial 1 will be a pilot experiment that compare how gene knockout salmon and wildtype salmon parr will respond to challenge with a wildtype SAV3 isolate.
Trial 2 will be a pilot experiment where wildtype salmon fry will be ip injected with 4 different doses of a clonal wildtype SAV3 - either as virus grown in-vitro from an infectious clone or as the infectious clone itself in the form of a plasmid.
Trial 3 will compare the infection kinetics in salmon fry ip injected with either a wildtype SAV3 clone (as in trial 2) or three SAV 3 clones that are all attenuated to a different degree.
Harmfulness – The experiments will be severe – SAV will cause mortality in fry and disease in parr.
Animals - The experiment will involve 700 Atlantic salmon (Salmo salar) – 150 parr and 550 alevin/fry. Approximately 40 of the parr are knockout mutants.
3R - The experiments will contribute to the development of more standardized fish models, virus models and challenge models. The contribution to 3R hence lie in a refinement of the methodology, that prospectively will reduce the number of fish needed in specific experiments and perhaps reduce the overall number of experiments needed to investigate a given problem.
1) To develop a better standardized and more reproducible system for experiments with live fish. Many of today’s fish experiments are performed with a genetically variable fish material and/or the few times a year when genetically homogenous fish are available at the desired size. Our (longer-term) purpose is to develop a system where the same fish strain, isolate or even clone can be used year-round. All else equal, this will increase the direct comparability between experiments and hence maximize the scientific value of each of them.
2) To test our experimentally based hypothesis that a variant of a specific innate immune gene is of importance for resistance to virus infection in nature. We have used CRISPR to knock out the gene and will use an experimental SAV challenge to compare knock-outs with wild type salmon.
3) To test if our genetically attenuated virus clones are indeed attenuated when introduced to fish. We have used in vitro experiments to verify attenuation in cell cultures, but virus infections work at an organismal level that cannot satisfactorily be simulated by cell lines. The attenuated virus will be a valuable reagent for understanding virus infection and host-pathogen interactions in general and hold considerable potential as a vaccine candidate against a severe viral disease.
4) To establish a standardized viral challenge model where virus clones (infectious plasmid constructs) will form the backbone of a highly consistent experimental system. Infectious plasmid constructs can easily be quantified, does not change as result of cell propagation and remain invariable over time – which all contribute to more a standardized challenge model and hence more comparable future experiments.
The application includes three separate pilot/small scale trials:
Trial 1 will be a pilot experiment that compare how gene knockout salmon and wildtype salmon parr will respond to challenge with a wildtype SAV3 isolate.
Trial 2 will be a pilot experiment where wildtype salmon fry will be ip injected with 4 different doses of a clonal wildtype SAV3 - either as virus grown in-vitro from an infectious clone or as the infectious clone itself in the form of a plasmid.
Trial 3 will compare the infection kinetics in salmon fry ip injected with either a wildtype SAV3 clone (as in trial 2) or three SAV 3 clones that are all attenuated to a different degree.
Harmfulness – The experiments will be severe – SAV will cause mortality in fry and disease in parr.
Animals - The experiment will involve 700 Atlantic salmon (Salmo salar) – 150 parr and 550 alevin/fry. Approximately 40 of the parr are knockout mutants.
3R - The experiments will contribute to the development of more standardized fish models, virus models and challenge models. The contribution to 3R hence lie in a refinement of the methodology, that prospectively will reduce the number of fish needed in specific experiments and perhaps reduce the overall number of experiments needed to investigate a given problem.
Etterevaluering
Forsøket er klassifisert som betydelig belastende og må etterevalueres av Mattilsynet.
Begrunnelse for etterevalueringen
Resultatene fra forsøket gir ny kunnskap både om egenskaper hos SAV3 og atlanterhavslaks. Alle innledende studier av virusets evne til å framkalle sykdom hos laks, ble gjennomført på cellekulturer. For å verifisere resultatene var det imidlertid nødvendig å benytte levende dyr.
Forsøket viste at man kan gjøre endringer i genomet til SAV3 og dermed oppnå ulike grader av svekkelse av virusets evne til å gi sykdom hos laks (attenuering). Mens smitte med villtype virus ga 100% dødelighet, ga det minst attenuerte virus om lag 60% dødelighet. De to mest attenuerte virusvariantene ga under 1% dødelighet. Resultatene viste også at smitte med svekkede virus ga 100% beskyttelse mot smitte med villtype virus. Ved bruk av CRISPR-metoden klarte forskerne å slå ut dyrenes immungener og dermed tilsynelatende redusere fiskens evne til å motstå virusinfeksjon. Forsøket viste også at laksyngel som holdes i sebrafisk-kar vil være et meget nyttig system for komplekse forsøk med laks.
Det ble benyttet totalt 807 i stedet for 700 fisk som opprinnelig var omsøkt forsøket. Årsaken til dette var en godkjent forlengelse av delforsøk 3. Av disse var 167 dyr i negative kontroller som hadde lav belastningsgrad. For de 640 dyrene som ble smittet med SAV3 ble belastningsgraden klassifisert som høy. Sykdomsutvikling og dødelighet var imidlertid lavere i de 240 dyrene som ble smittet med de mest svekkede variantene av SAV3.
Søker informerer om at dyrene ble minimum observert to ganger per dag mht. kriteriet for humane endepunkt som var «døende». Dødelighet forårsaket av SAV3 er det viktigste utfallet i forsøket. Derfor er det vanskelig å redusere belastningsgraden ytterligere. Når man får mer erfaring med smitte-modell og forsøksdesign, kan det likevel være en mulighet for at man i noen tilfeller, kan bruke andre vitenskapelige endepunkter som gjør det mulig å avslutte forsøk før alvorlig sykdom og død inntreffer. Man planlegger videobasert analyse av 'oppførsel' (f.eks. appetitt) som en indikator for sykdomsgrad. Dette vil kunne bli nyttig 'scorings'-parameter for fremtidige forsøk der lakseunger blir holdt i kar for sebrafisk.
Forsøket viste at man kan gjøre endringer i genomet til SAV3 og dermed oppnå ulike grader av svekkelse av virusets evne til å gi sykdom hos laks (attenuering). Mens smitte med villtype virus ga 100% dødelighet, ga det minst attenuerte virus om lag 60% dødelighet. De to mest attenuerte virusvariantene ga under 1% dødelighet. Resultatene viste også at smitte med svekkede virus ga 100% beskyttelse mot smitte med villtype virus. Ved bruk av CRISPR-metoden klarte forskerne å slå ut dyrenes immungener og dermed tilsynelatende redusere fiskens evne til å motstå virusinfeksjon. Forsøket viste også at laksyngel som holdes i sebrafisk-kar vil være et meget nyttig system for komplekse forsøk med laks.
Det ble benyttet totalt 807 i stedet for 700 fisk som opprinnelig var omsøkt forsøket. Årsaken til dette var en godkjent forlengelse av delforsøk 3. Av disse var 167 dyr i negative kontroller som hadde lav belastningsgrad. For de 640 dyrene som ble smittet med SAV3 ble belastningsgraden klassifisert som høy. Sykdomsutvikling og dødelighet var imidlertid lavere i de 240 dyrene som ble smittet med de mest svekkede variantene av SAV3.
Søker informerer om at dyrene ble minimum observert to ganger per dag mht. kriteriet for humane endepunkt som var «døende». Dødelighet forårsaket av SAV3 er det viktigste utfallet i forsøket. Derfor er det vanskelig å redusere belastningsgraden ytterligere. Når man får mer erfaring med smitte-modell og forsøksdesign, kan det likevel være en mulighet for at man i noen tilfeller, kan bruke andre vitenskapelige endepunkter som gjør det mulig å avslutte forsøk før alvorlig sykdom og død inntreffer. Man planlegger videobasert analyse av 'oppførsel' (f.eks. appetitt) som en indikator for sykdomsgrad. Dette vil kunne bli nyttig 'scorings'-parameter for fremtidige forsøk der lakseunger blir holdt i kar for sebrafisk.