Generere og karakterisere en homozygot NAA80 KO sebrafisklinje
a)Formål
N-terminale acetyltransferaser (NATer) er involvert i sykdomsprosesser, inkludert kreft og utviklingsforstyrrelser. For å oppnå kunnskap om disse prosessene har vi kjøpt en sebrafisklinje som er heterozygot knockout for et NAT-gen. Vi har observert krysninger av naa80+/- fisk, og funnet ut at det ikke er noen effekter av naa80-/- ved tidlig utvikling. Videre ble disse fiskene observert frem til voksen alder, uten at noen fenotyper har manifestert seg. Vi forsøkte å krysse naa80-/-, men har ikke fått noen egg fra denne krysningen, så den eneste fenotypen er at naa80-/- muligens er infertile. Vi ønsker å opprettholde avkom av naa80+/- for å studere fertilitet nærmere. I tillegg vil vi gjøre undersøkelser av vev fra eutanasert fisk, for å se på muskel- og hjertemorfologi. Vi ønsker fortsatt å genotype naa80+/- avkom med finneklipping for å slå fast fenotype.
b)Skadevirkninger
Ubehag/smerte etter finneklipping. Klippingen skjer under bedøvelse med bufret tricain. Ubehag forbundet med isolering i maks fem dager mens genotypingen foregår.
c)forventet vitenskapelig/samfunnsmessig nytteverdi
NAT-genet som blir slått ut, naa80, koder for et enzym som er involvert i funksjonen til aktin, et viktig protein i muskler og i celleskjelettet. Tap av NAA80 i humane celler fører til tap av acetylering og at cellene har abnormal størrelse og beveger seg raskere enn normalt. Det finnes ingen dyremodeller for NAA80, noe som trengs for å studere funksjonen til NAA80 i en utviklingskontekst. Vi har tidligere forsøkt å slå ned naa80 med morfolinoer, men dette virker ikke, siden genet må slås ut for å bli kvitt all aktivitet. En homozygot naa80-KO modell er den eneste måten vi kan oppnå denne kunnskapen på. Vi vet at heterozygote bærere (naa80+/-) har intakt aktinacetylering, så vi er avhengige av å identifisere naa80-/- bærere.
d)Antall dyr, art
812 sebrafisk, AB-bakgrunn,>90 dpf.
e)3R
Replace: funksjonen til NAA80 i fosterutvikling kan bare studeres i konteksten av en utviklende organisme som mangler NAA80. Derfor behøves det en vertebrat modell. Det er nødvendig å ta vev fra voksne fisk for å genotype.
Reduce: vi trenger to linjer med forskjellige mutasjoner for å styrke konklusjonene våre. Det trengs opp til 25 fisk av hver genotype. Siden naa80-/- fisk ikke gir egg er det nødvendig å finneklippe hver generasjon for å identifisere bærere av allelet. Screening opphører når vi identifiserer mange nok individer (25 med naa80-/- per linje per generasjon i F3 og F4). Finneklipping skjer bare en gang per fisk.
Refine: Fenotypen til naa80-KO er liten/ikke belastende, basert på studier av naa80-/- og naa80+/- fisk. Larver, unge fisk og voksne fisk trives likt med villtype-fisk, og har ikke høyere forekomst av utviklingsdefekter enn villtypefisk.
Finneklipping er ansett som en mildt belastende intervensjon, og er mindre belastende enn å ta en blodprøve for å genotype. Vevsbiten som fjernes er så liten som mulig, klippingen foregår under bedøvelse, og fisken plasseres i isolasjon så kort tid som mulig. Fisken blir sjekket ofte etter finneklippingen, og vil bli avlivet dersom det er tegn på unormal oppførsel eller infeksjon (endepunkter er definert i Metodebeskrivelse -> Humane endepunkter.
N-terminale acetyltransferaser (NATer) er involvert i sykdomsprosesser, inkludert kreft og utviklingsforstyrrelser. For å oppnå kunnskap om disse prosessene har vi kjøpt en sebrafisklinje som er heterozygot knockout for et NAT-gen. Vi har observert krysninger av naa80+/- fisk, og funnet ut at det ikke er noen effekter av naa80-/- ved tidlig utvikling. Videre ble disse fiskene observert frem til voksen alder, uten at noen fenotyper har manifestert seg. Vi forsøkte å krysse naa80-/-, men har ikke fått noen egg fra denne krysningen, så den eneste fenotypen er at naa80-/- muligens er infertile. Vi ønsker å opprettholde avkom av naa80+/- for å studere fertilitet nærmere. I tillegg vil vi gjøre undersøkelser av vev fra eutanasert fisk, for å se på muskel- og hjertemorfologi. Vi ønsker fortsatt å genotype naa80+/- avkom med finneklipping for å slå fast fenotype.
b)Skadevirkninger
Ubehag/smerte etter finneklipping. Klippingen skjer under bedøvelse med bufret tricain. Ubehag forbundet med isolering i maks fem dager mens genotypingen foregår.
c)forventet vitenskapelig/samfunnsmessig nytteverdi
NAT-genet som blir slått ut, naa80, koder for et enzym som er involvert i funksjonen til aktin, et viktig protein i muskler og i celleskjelettet. Tap av NAA80 i humane celler fører til tap av acetylering og at cellene har abnormal størrelse og beveger seg raskere enn normalt. Det finnes ingen dyremodeller for NAA80, noe som trengs for å studere funksjonen til NAA80 i en utviklingskontekst. Vi har tidligere forsøkt å slå ned naa80 med morfolinoer, men dette virker ikke, siden genet må slås ut for å bli kvitt all aktivitet. En homozygot naa80-KO modell er den eneste måten vi kan oppnå denne kunnskapen på. Vi vet at heterozygote bærere (naa80+/-) har intakt aktinacetylering, så vi er avhengige av å identifisere naa80-/- bærere.
d)Antall dyr, art
812 sebrafisk, AB-bakgrunn,>90 dpf.
e)3R
Replace: funksjonen til NAA80 i fosterutvikling kan bare studeres i konteksten av en utviklende organisme som mangler NAA80. Derfor behøves det en vertebrat modell. Det er nødvendig å ta vev fra voksne fisk for å genotype.
Reduce: vi trenger to linjer med forskjellige mutasjoner for å styrke konklusjonene våre. Det trengs opp til 25 fisk av hver genotype. Siden naa80-/- fisk ikke gir egg er det nødvendig å finneklippe hver generasjon for å identifisere bærere av allelet. Screening opphører når vi identifiserer mange nok individer (25 med naa80-/- per linje per generasjon i F3 og F4). Finneklipping skjer bare en gang per fisk.
Refine: Fenotypen til naa80-KO er liten/ikke belastende, basert på studier av naa80-/- og naa80+/- fisk. Larver, unge fisk og voksne fisk trives likt med villtype-fisk, og har ikke høyere forekomst av utviklingsdefekter enn villtypefisk.
Finneklipping er ansett som en mildt belastende intervensjon, og er mindre belastende enn å ta en blodprøve for å genotype. Vevsbiten som fjernes er så liten som mulig, klippingen foregår under bedøvelse, og fisken plasseres i isolasjon så kort tid som mulig. Fisken blir sjekket ofte etter finneklippingen, og vil bli avlivet dersom det er tegn på unormal oppførsel eller infeksjon (endepunkter er definert i Metodebeskrivelse -> Humane endepunkter.