Betinget sletting av nevrotransmittertransporører - Vedlikehold (copy)
Sykdommer som affiserer nervesystemet, er samlet sett ansvarlige for flere sykehusdøgn, mer langtidspleie og mer lidelse enn alle andre sykdommer til sammen. På tross av imponerende fremskritt innen andre medisinske felter, er vår evne til å forebygge og behandle nevrologiske sykdommer deprimerende svak. Selv om de ulike sykdommene har ulike årsaker (som i hovedsak er ukjente), er forstyrrelser i hjernens håndtering av glutamat beskrevet i samtlige. Glutamat er hjernens viktigste eksitatoriske nevrotransmitter og inngår i nær sagt alle hjernens funksjoner. Både for lite og for mye glutamat er skadelig. Man har antatt at forstyrret glutamatomsetningen bidrar til sykdomsutviklingen. Denne hypotesen har hatt vesentlig betydning for styringen av nevrologisk forskning de siste 50 år. Men på tross av enorme investeringer (dyr og penger) har forsøk på å regulere glutamatomsetningen knapt ledet til noen nye terapier. Dette tyder på at teorier som nærmest har status som sannheter, kan ha vesentlige svakheter. En kritisk gjennomgang av de rådende forestillinger vedr glutamat er derved påkrevet. Det aktuelle prosjekt tar sikte på å studere hjernens håndtering av glutamat og relaterte substanser (f.eks. GABA, cystin, taurin og glutamin) ved å benytte genetisk modifiserte mus som mangler relevante transportører (f.eks. EAAT1, EAAT2, EAAT3, GAT1, GAT2, GAT3, xCT) eller enzymer (f.eks. glutaminsyntetase eller glutaminase). Fordi flere av disse proteinene er livsviktige, må slettingen av gener begrenses til visse regioner eller celletyper. Fordi de også spiller rolle for hjernens utvikling, vil slettingen i noen tilfeller måtte gjøres induserbar slik at den utføres ved bestemte aldere. Poenget med studiet er å bestemme hvilken rolle de enkelte proteinene spiller i normalsituasjonen og om mangel kan føre til sykdom. Vi må kunne skille mellom primære og sekundære effekter. F.eks. vil celledød initiere betennelsesreaksjoner som i sin tur vil kunne påvirke mange ulike systemer. Følgelig ønsker vi å undersøke dyr mens de fortsatt har god helse. Studiet har derved ikke behov for å holde i live dyr som lider. Dette er altså ikke smertevoldende dyreforsøk. Forsøkene går ut på å avle dyr med ulike genetiske endringer enten alene eller i kombinasjon. Dyr vil bli avlivet ved ulike aldre for in vitro undersøkelser for kartlegging av prosesser som kommer før kliniske symptomer. Mens de er i live vil de bli observert mhp vekt og adferd. Vi vil føre statistikk over overlevelse (plutselig død slik som ved epilepsi eller død som følge avlivning grunnet sykdom). Antallet dyr kan ikke forutbestemmes nøyaktig fordi dette blir å følge et større antall dyr med ulike genendringer og kartlegge konsekvenser. Vedlikeholds avl vil i seg selv innebære en god del dyr og derved statistikk. Vi søker å ta vare på så mye vi kan av det materiale vi produserer. Takket være et avansert databasesystem holder vi orden på data og dyrene prøvene kommer fra. Et viktig moment når det gjelder reduksjon av antall forsøksdyr, er å publisere korrekte konklusjoner. Å korrigere en publisert påstand er mye mer kostbart (ikke minst i form av forsøksdyr) enn det var å fremsette den.
Etterevaluering
De genetiske modifiseringene for et lite antall mus er slik at deres velferd kan bli betydelig negativt påvirket, og vi klassifiserer derfor forsøket som betydelig belastende, jf. forsøksdyrforskriften vedlegg B.
Alle forsøk som er betydelig belastende skal etterevalueres av Mattilsynet.
Alle forsøk som er betydelig belastende skal etterevalueres av Mattilsynet.
Begrunnelse for etterevalueringen
Sykdommer som affiserer nervesystemet har ulike årsaker som i stor grad er ukjente, men forstyrrelser i hjernens håndtering av glutamat er beskrevet for alle disse sykdommene. Omfattende forskning som gjelder regulering av hjernens glutamat-omsetning har likevel ikke ført til store fremskritt når det gjelder behandlinger.
Dette gjør at det er nødvendig å gjennomgå dagens kunnskap om glutamat og dets betydning for sykdomsutvikling.
Forsøkets formål har vært å studere hjernens håndtering av glutamat og relaterte substanser. Dette er gjennomført ved å benytte ulike genetisk modifiserte mus som mangler relevante transportører eller enzymer.
Det er gjennomført observasjoner og enkle atferdstester for fenotypisk karakterisering av musene, og organer og vev er tatt ut etter avliving for in vitro-studier.
Da forsøket ble godkjent vurderte Mattilsynet at forsøket for de aller fleste musene ville være lett belastende, som angitt av forsøksansvarlig.
For et lite antall mus er imidlertid de genetiske endringene slik at musenes velferd kan bli betydelig negativt påvirket, og forsøksprosjektet ble derfor klassifisert i sin helhet som betydelig belastende.
Forsøksansvarlig angir at prosjektet har vært vellykket, da det har gitt mye viktig informasjon som forklarer divergerende oppfatninger i litteraturen.
Det overordnete formålet har vært å se om fenotypene man får er de man kunne forvente basert på eksisterende kunnskap. I stor utstrekning har fenotypene vært annerledes og mildere enn antatt, og forskergruppen har derved fått mange overraskende funn og mye data.
En hypotese som har spilt en svært stor rolle for styringen av nevrologisk forskning de siste tiårene er at overaktivering av glutamatreseptorer bidrar til nervecelledød. Data fra dette forsøksprosjektet gir helt ny informasjon om dette fenomenet.
En annen viktig ting er i hvilken grad transmitter- glutamat inaktiveres ved opptak i gliaceller, og i hvilken grad direkte opptak i nerveceller bidrar.
Dette er to eksempler på type av informasjon som er grunnleggende for tolkning av sykdomsdata.
Det er publisert 9 artikler om dette siden oppstart av prosjektet, mens det fremdeles arbeides med å beskrive og presentere de fleste av funnene.
Belastningsgraden var mildere enn forventet. De fleste linjene kommer i kategorien milde. Av de linjene som er brukt, er det bare to som bør klassifiseres som moderate og ingen med betydelig belastning.
Den faktiske belastningsgraden har vært mild i de fleste tilfeller. Nedenfor følger 3 eksempler:
# For en av linjene man trodde skulle utvikle en alvorlig fenotype, er det ikke oppdaget noen klinisk fenotype i det hele tatt. Men fordi man histologisk ser et tap av pyramideceller i CA1 hippocampus, antar forskergruppen (uten å ha testet) at musene vil prestere dårligere i tester slik som f.eks. watermaze, novel object recognition etc). Fenotypen er mild.
# Forskergruppen trodde at en av de andre linjene hadde høy prenatal dødelighet fordi få av musene som ble genotypet var homozygote KO'er. Men da forskerne begynte å genotype rett etter fødsel, fant de at KO'er ble født i forventet (Mendelsk) antall, dvs. det var ikke noe som indikerte økt tap prenatalt. Musene som vokser opp, er tilsynelatende friske.
# Også den linjen det var mest bekymring for har vist seg å ha en mildere fenotype enn opprinnelig antatt. Vektreduksjonen og dødeligheten i tredje og fjerde leveuke er sterkt redusert ved å utsette separasjon fra moren noen dager og ved å legge mat i bunnen av buret i mer enn en uke.
Det er en økt dødelighet gjennom hele livet, men forskergruppen har ikke klart å forutse hvilke mus som dør. Regelen er at noen plutselig dør, og forskergruppen antar at dette skyldes epilepsi. Ved nærmere undersøkelse av disse musene (upublisert), fikk forskerne svært overraskende funn som forklarer en mengde tilsynelatende motsigende resultater i litteraturen.
Noen eksempler er nevnt over. For en av linjene er det nødvendig å genotype første levedøgn slik at det kan påses at de får nok melk. For en annen linje øker overlevelsen rett og slett ved å vente noen dager med separasjon fra moren og ved å la det ligge mat på gulvet i buret i lengre tid.
Forskergruppen har altså gjort noen forbedringer, men utgangspunktet her er at fenotypene er overraskende milde.
Det ble brukt 242 av 4070 godkjente mus i forsøksprosjektet.
Ved avslutning av forsøket ble musene dypt anestesert og perfusjonsfiksert. I tillegg er det samlet inn vev fra overskuddsdyr for in vitro forsøk.
Prosjektet kom sent i gang på grunn av ufullstendige helserapporter, som forhindret overføring av dyr til forsøksdyravdelingen.
Lavere aktivitet enn planlagt skyldes også Corona-pandemien.
Dette gjør at det er nødvendig å gjennomgå dagens kunnskap om glutamat og dets betydning for sykdomsutvikling.
Forsøkets formål har vært å studere hjernens håndtering av glutamat og relaterte substanser. Dette er gjennomført ved å benytte ulike genetisk modifiserte mus som mangler relevante transportører eller enzymer.
Det er gjennomført observasjoner og enkle atferdstester for fenotypisk karakterisering av musene, og organer og vev er tatt ut etter avliving for in vitro-studier.
Da forsøket ble godkjent vurderte Mattilsynet at forsøket for de aller fleste musene ville være lett belastende, som angitt av forsøksansvarlig.
For et lite antall mus er imidlertid de genetiske endringene slik at musenes velferd kan bli betydelig negativt påvirket, og forsøksprosjektet ble derfor klassifisert i sin helhet som betydelig belastende.
Forsøksansvarlig angir at prosjektet har vært vellykket, da det har gitt mye viktig informasjon som forklarer divergerende oppfatninger i litteraturen.
Det overordnete formålet har vært å se om fenotypene man får er de man kunne forvente basert på eksisterende kunnskap. I stor utstrekning har fenotypene vært annerledes og mildere enn antatt, og forskergruppen har derved fått mange overraskende funn og mye data.
En hypotese som har spilt en svært stor rolle for styringen av nevrologisk forskning de siste tiårene er at overaktivering av glutamatreseptorer bidrar til nervecelledød. Data fra dette forsøksprosjektet gir helt ny informasjon om dette fenomenet.
En annen viktig ting er i hvilken grad transmitter- glutamat inaktiveres ved opptak i gliaceller, og i hvilken grad direkte opptak i nerveceller bidrar.
Dette er to eksempler på type av informasjon som er grunnleggende for tolkning av sykdomsdata.
Det er publisert 9 artikler om dette siden oppstart av prosjektet, mens det fremdeles arbeides med å beskrive og presentere de fleste av funnene.
Belastningsgraden var mildere enn forventet. De fleste linjene kommer i kategorien milde. Av de linjene som er brukt, er det bare to som bør klassifiseres som moderate og ingen med betydelig belastning.
Den faktiske belastningsgraden har vært mild i de fleste tilfeller. Nedenfor følger 3 eksempler:
# For en av linjene man trodde skulle utvikle en alvorlig fenotype, er det ikke oppdaget noen klinisk fenotype i det hele tatt. Men fordi man histologisk ser et tap av pyramideceller i CA1 hippocampus, antar forskergruppen (uten å ha testet) at musene vil prestere dårligere i tester slik som f.eks. watermaze, novel object recognition etc). Fenotypen er mild.
# Forskergruppen trodde at en av de andre linjene hadde høy prenatal dødelighet fordi få av musene som ble genotypet var homozygote KO'er. Men da forskerne begynte å genotype rett etter fødsel, fant de at KO'er ble født i forventet (Mendelsk) antall, dvs. det var ikke noe som indikerte økt tap prenatalt. Musene som vokser opp, er tilsynelatende friske.
# Også den linjen det var mest bekymring for har vist seg å ha en mildere fenotype enn opprinnelig antatt. Vektreduksjonen og dødeligheten i tredje og fjerde leveuke er sterkt redusert ved å utsette separasjon fra moren noen dager og ved å legge mat i bunnen av buret i mer enn en uke.
Det er en økt dødelighet gjennom hele livet, men forskergruppen har ikke klart å forutse hvilke mus som dør. Regelen er at noen plutselig dør, og forskergruppen antar at dette skyldes epilepsi. Ved nærmere undersøkelse av disse musene (upublisert), fikk forskerne svært overraskende funn som forklarer en mengde tilsynelatende motsigende resultater i litteraturen.
Noen eksempler er nevnt over. For en av linjene er det nødvendig å genotype første levedøgn slik at det kan påses at de får nok melk. For en annen linje øker overlevelsen rett og slett ved å vente noen dager med separasjon fra moren og ved å la det ligge mat på gulvet i buret i lengre tid.
Forskergruppen har altså gjort noen forbedringer, men utgangspunktet her er at fenotypene er overraskende milde.
Det ble brukt 242 av 4070 godkjente mus i forsøksprosjektet.
Ved avslutning av forsøket ble musene dypt anestesert og perfusjonsfiksert. I tillegg er det samlet inn vev fra overskuddsdyr for in vitro forsøk.
Prosjektet kom sent i gang på grunn av ufullstendige helserapporter, som forhindret overføring av dyr til forsøksdyravdelingen.
Lavere aktivitet enn planlagt skyldes også Corona-pandemien.