Revealing nanoscale dyadic structure in the normal and failing heart
I. The purpose of the project: A: Å gi økt innsikt i organisering av og funksjonen til dyadene i kardiomyocytter i det friske og sviktende hjertet. B: Dokumentasjon og etablering av mest mulig optimal analgesi i kirurgiske modeller i rotte
II. The expected adverse effects on the animals: A+B: Betydelig belastende (se Begrunnelse)
III. The expected scientific benefits or benefits for society:
A: For å redusere pasienters lidelse og den sosioøkonomiske byrden som hjertesvikt medfører er det essensielt at ny terapi utvikles. Våre data indikerer at dysfunksjon i det sviktende hjertet kan spores tilbake til endret struktur og funksjon hos kardiomyocyttene, i sub-cellulære strukturer kalt dyader. Ved å forstå dyadenes struktur/funksjon samt prosessene som regulerer dem, kan nye terapeutiske mål identifiseres.
B: Analgesi av gnagere i forbindelse med eksperimentelle kirurgiske prosedyrer er av stor praktisk betydning for dyrevelferd og relevansen av den kunnskap som genereres gjennom bruk av forsøksdyr. Sattellittprosjekt B vil bidra ved å dokumentere analgesiprotokoller i kirurgiske modeller for induksjon av myokardielt infarkt i rotte. Hensikten med prosjektet er etablering av medikamentelle regimer som muliggjør lengst mulig doseringsfrekvens og minst mulig stress for dyrene.
IV. The number of animals and species: 732 Wistar rats (600 in A + 132 in B)
V. How will the requirements for 3R be accomplished by the project:
A: Når mulig vil celler, vev og data fra disse dyrene deles med andre forskere for å redusere bruken av dyr.
B: Prosjektet for evaluering av analgesiprotokoller integreres som et sattelittprosjekt i et eksisterende hovedprosjektl (FOTS ID 15889) hvor den aktuelle kirurgi utføres med henblikk på å studere utvikling av hjertesvikt etter påført myokardielt infarkt i rotte. Dersom teknisk mulig vil innsamling av data vha Accusampler etter operasjon 1 og 2 i sattellittprosjekt B kunne gjøres på en del av de 600 dyr som planlegges bruk i hovedprosjektet (A). Om dette er mulig benyttes dyrene til å skaffe kunnskap om forbedret analgesi i en realistisk kirurgisk modell, samtidig som dyrene etterfølgende bidrar med eksperimentelle data av betydning for forståelsen av subcellulære prosesser i forbindelse med hjertesvikt. Antallet dyr som benyttes i prosjekt A og B vil da være lavere, ned mott 600 totalt. Kirurgien utføres av forskere med stor erfaring innen de aktuelle kirurgiske inngrep. Automatisk uttak av prøver er en forutsetning for å oppnå relevante data, men utgjør også et bidrag i seg selv til mindre stress. Det benyttes ikke en egentlig negativ kontrollgruppe (som ikke får analgesi). Kontrollgruppen representeres av dyr som får Temgesic analgesiregime (sc injeksjoner under fysisk fengsling). Prosjektet vil øke den generelle kunnskapen om anestesi av forsøksdyr og vil bidra til å øke kvaliteten på forskning som benytter gnagere, og vil gjennom publisering utgjøre et verdifullt praktisk bidrag til utvikling av 3R innen bruk av forsøksdyr.
II. The expected adverse effects on the animals: A+B: Betydelig belastende (se Begrunnelse)
III. The expected scientific benefits or benefits for society:
A: For å redusere pasienters lidelse og den sosioøkonomiske byrden som hjertesvikt medfører er det essensielt at ny terapi utvikles. Våre data indikerer at dysfunksjon i det sviktende hjertet kan spores tilbake til endret struktur og funksjon hos kardiomyocyttene, i sub-cellulære strukturer kalt dyader. Ved å forstå dyadenes struktur/funksjon samt prosessene som regulerer dem, kan nye terapeutiske mål identifiseres.
B: Analgesi av gnagere i forbindelse med eksperimentelle kirurgiske prosedyrer er av stor praktisk betydning for dyrevelferd og relevansen av den kunnskap som genereres gjennom bruk av forsøksdyr. Sattellittprosjekt B vil bidra ved å dokumentere analgesiprotokoller i kirurgiske modeller for induksjon av myokardielt infarkt i rotte. Hensikten med prosjektet er etablering av medikamentelle regimer som muliggjør lengst mulig doseringsfrekvens og minst mulig stress for dyrene.
IV. The number of animals and species: 732 Wistar rats (600 in A + 132 in B)
V. How will the requirements for 3R be accomplished by the project:
A: Når mulig vil celler, vev og data fra disse dyrene deles med andre forskere for å redusere bruken av dyr.
B: Prosjektet for evaluering av analgesiprotokoller integreres som et sattelittprosjekt i et eksisterende hovedprosjektl (FOTS ID 15889) hvor den aktuelle kirurgi utføres med henblikk på å studere utvikling av hjertesvikt etter påført myokardielt infarkt i rotte. Dersom teknisk mulig vil innsamling av data vha Accusampler etter operasjon 1 og 2 i sattellittprosjekt B kunne gjøres på en del av de 600 dyr som planlegges bruk i hovedprosjektet (A). Om dette er mulig benyttes dyrene til å skaffe kunnskap om forbedret analgesi i en realistisk kirurgisk modell, samtidig som dyrene etterfølgende bidrar med eksperimentelle data av betydning for forståelsen av subcellulære prosesser i forbindelse med hjertesvikt. Antallet dyr som benyttes i prosjekt A og B vil da være lavere, ned mott 600 totalt. Kirurgien utføres av forskere med stor erfaring innen de aktuelle kirurgiske inngrep. Automatisk uttak av prøver er en forutsetning for å oppnå relevante data, men utgjør også et bidrag i seg selv til mindre stress. Det benyttes ikke en egentlig negativ kontrollgruppe (som ikke får analgesi). Kontrollgruppen representeres av dyr som får Temgesic analgesiregime (sc injeksjoner under fysisk fengsling). Prosjektet vil øke den generelle kunnskapen om anestesi av forsøksdyr og vil bidra til å øke kvaliteten på forskning som benytter gnagere, og vil gjennom publisering utgjøre et verdifullt praktisk bidrag til utvikling av 3R innen bruk av forsøksdyr.
Etterevaluering
Forsøket er klassifisert som betydelig belastende og skal derfor etterevalueres.
Begrunnelse for etterevalueringen
Nyere data indikerer at dysfunksjon ved hjertesvikt kan spores tilbake til endret struktur og funksjon hos kardiomyocyttene, i subcellulære strukturer kalt dyader.
Forsøkets formål har vært å gi økt innsikt i organisering av og funksjonen til dyadene i det friske og sviktende hjertet.
I del A av prosjektet observerte forskergruppen at dyadene blir demontert under hjertesvikt, noe som gir en kritisk mekanisme som ligger til grunn for redusert hjertefunksjon ved denne sykdommen.
Det eksperimentelle arbeidet har vist at endringer i kardiomyocytt-understrukturen bidrar til utvikling av hjertesvikt. Proteiner som er involvert i endring av dyadisk struktur (Bin1, dynamin-2, Mtm1), kan målrettes i fremtidig arbeid.
I del B av prosjektet ble metode for kateterisering og tilkobling til Accusampler etablert for automatisert uttak av blodprøver fra våkne rotter. Metoden ble benyttet til å ta blodprøver i 72 timer etter myokardiell infarkt-operasjon, slik at kinetikken av kortikosteron og buprenorfin kunne følges etter oral og subkutan dosering.
Forsøkene med bruk av robot viste ingen forskjell i kortikosteron mellom doseringsrutene, men statistisk og biologisk signifikante forskjeller i serumnivåer og kinetikk av serum buprenorfin mellom subkutan og oral dosering. Oral dosering medfører mer stabile og klinisk effektive serumverdier.
Basert på dette ble endringsmelding levert for utprøving av oral dosering i rotter som IKKE var kateteriserte før infarktoperasjon (med subkutan buprenorfin som kontroll).
Resultatene fra utprøvingen viste at vekttap etter operasjon var signifikant mindre etter oral dosering.
Vurdering av «behaviour-based pain assessment» 12 og 24 timer etter operasjon viste ikke signifikant forskjell, men en tydelig tendens til lavere score etter oral dosering.
De eksperimentelle målene for prosjektet ble nådd, da forskergruppen fikk ny innsikt i de cellulære mekanismene for hjertesvikt, og har etablert data som understøtter effektivitet av oral dosering med buprenorfin etter toraks-kirurgi i rotte.
Frivillig oral dosering av buprenorfin via Nutella er mulig før operasjon, men etter operasjon er rottene uinteressert i Nutella, slik at dosering til planlagte tidspunkter ikke er mulig eller forsvarlig.
Data ble presentert på FELASA-kongressen 2022, og manuskript er under utarbeidelse. Oral dosering er etablert som metode i flere forsøk med rotte ved KPM-OUS, og erfaringene er svært gode.
Det har vært en fremgang i bruken av kardiomyocytter fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Modenheten til disse cellene er nå slik at mange grunnleggende aspekter ved hjertefysiologi kan testes med mer begrenset bruk av dyremodeller.
Forskergruppen har vist at umodne kardiomyocytter kan modellere mange aspekter av sykdomstilstander (Lipsett et al., J Physiol 2019). Denne kunnskapen vil bidra til å redusere bruken av hjertesviktmodelldyr i fremtiden, samtidig som den gir kritisk tilgang til menneskeceller, som har viktige forskjeller fra gnagere.
Forsøksansvarlig angir at det er ønskelig å bruke induserte pluripotente stamceller for å undersøke kardiomyocytt-fysiologi. Foreløpig er rottemodellen for hjertesvikt etter infarkt fortsatt gullstandarden for å undersøke cellulære mekanismer for sykdomsprogresjon.
Humant vev er også tilgjengelig fra hjerter eksplantert under transplantasjonskirurgi, men tilgjengeligheten av kontrollhjerter er ekstremt begrenset. I tillegg får man ved slik bruk bare innsikt i sluttstadiet av sykdommen i menneskelige hjerter, ikke tidligere stadier av sykdomsprogresjon.
Noen dyr i del A viste tegn på smerte som krevde behandling med analgetika etter operasjon, utover den forventede behandlingsperioden. Dyr som viste tegn på infeksjon eller dekompensert hjertesvikt ble avlivet i henhold til angitte humane endepunkter.
101 rotter i del A, som hadde gjennomgått infarktoperasjoner men ikke kateterisering og undersøkelse med Accusampler, ble registrert som betydelig belastende i 2019 og 2020. Infarktkirurgi alene skulle kun vært registrert som moderat belastende, slik det var planlagt i den opprinnelige søknaden, og slik det ble observert og vurdert klinisk.
613 dyr ble brukt.
Totalt 48 dyr benyttet til del B er rapportert som betydelig belastende i årsrapporter i 2019 og 2020. Vurderingen var basert på kliniske observasjoner og den kumulative belastning fra 2 prosedyrer: 1) katerisering av a. carotis, og 2) kirurgisk inngrep for etablering av myokardielt infarkt og tilkobling til Accusampler.
Basert på kliniske observasjoner har forsøksmedarbeiderne vurdert at prosedyrene i del B var betydelig belastende i opptil 48 timer for disse dyrene.
Forskergruppen brukte 15 % færre dyr enn forventet (612 i stedet for 732 dyr). Dette ble muliggjort med ansettelse av en ekstra PhD-student som utførte parallelle eksperimenter på celler fra post-infarkt- dyr. Dermed ble det oppnådd flere celleopptak fra hvert dyr enn planlagt.
Forsøksansvarlig angir at det ikke er trolig at belastningen på dyrene kunne vært ytterligere redusert. Dyrehelsen ble regelmessig overvåket, spesielt hos dyr etter operasjon. Dyr som opplevde smerte ble raskt behandlet.
For del B er intermitterende tilkobling i forbindelse med uttak av blodprøve fra sampling button i nakken en mulighet. Dette vil være mindre belastende for dyrene, men manuelt uttak av blodprøve vil påvirke serum kortikosteron, og er derfor uheldig for dette formålet.
Forsøksansvarlig angir at de to humane endepunktene, sårinfeksjon og dekompensert hjertesvikt, var hensiktsmessige, og at forsøksmedarbeiderne effektivt kunne identifisere dyr som nærmet seg en uakseptabel belastning.
Forsøkets formål har vært å gi økt innsikt i organisering av og funksjonen til dyadene i det friske og sviktende hjertet.
I del A av prosjektet observerte forskergruppen at dyadene blir demontert under hjertesvikt, noe som gir en kritisk mekanisme som ligger til grunn for redusert hjertefunksjon ved denne sykdommen.
Det eksperimentelle arbeidet har vist at endringer i kardiomyocytt-understrukturen bidrar til utvikling av hjertesvikt. Proteiner som er involvert i endring av dyadisk struktur (Bin1, dynamin-2, Mtm1), kan målrettes i fremtidig arbeid.
I del B av prosjektet ble metode for kateterisering og tilkobling til Accusampler etablert for automatisert uttak av blodprøver fra våkne rotter. Metoden ble benyttet til å ta blodprøver i 72 timer etter myokardiell infarkt-operasjon, slik at kinetikken av kortikosteron og buprenorfin kunne følges etter oral og subkutan dosering.
Forsøkene med bruk av robot viste ingen forskjell i kortikosteron mellom doseringsrutene, men statistisk og biologisk signifikante forskjeller i serumnivåer og kinetikk av serum buprenorfin mellom subkutan og oral dosering. Oral dosering medfører mer stabile og klinisk effektive serumverdier.
Basert på dette ble endringsmelding levert for utprøving av oral dosering i rotter som IKKE var kateteriserte før infarktoperasjon (med subkutan buprenorfin som kontroll).
Resultatene fra utprøvingen viste at vekttap etter operasjon var signifikant mindre etter oral dosering.
Vurdering av «behaviour-based pain assessment» 12 og 24 timer etter operasjon viste ikke signifikant forskjell, men en tydelig tendens til lavere score etter oral dosering.
De eksperimentelle målene for prosjektet ble nådd, da forskergruppen fikk ny innsikt i de cellulære mekanismene for hjertesvikt, og har etablert data som understøtter effektivitet av oral dosering med buprenorfin etter toraks-kirurgi i rotte.
Frivillig oral dosering av buprenorfin via Nutella er mulig før operasjon, men etter operasjon er rottene uinteressert i Nutella, slik at dosering til planlagte tidspunkter ikke er mulig eller forsvarlig.
Data ble presentert på FELASA-kongressen 2022, og manuskript er under utarbeidelse. Oral dosering er etablert som metode i flere forsøk med rotte ved KPM-OUS, og erfaringene er svært gode.
Det har vært en fremgang i bruken av kardiomyocytter fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Modenheten til disse cellene er nå slik at mange grunnleggende aspekter ved hjertefysiologi kan testes med mer begrenset bruk av dyremodeller.
Forskergruppen har vist at umodne kardiomyocytter kan modellere mange aspekter av sykdomstilstander (Lipsett et al., J Physiol 2019). Denne kunnskapen vil bidra til å redusere bruken av hjertesviktmodelldyr i fremtiden, samtidig som den gir kritisk tilgang til menneskeceller, som har viktige forskjeller fra gnagere.
Forsøksansvarlig angir at det er ønskelig å bruke induserte pluripotente stamceller for å undersøke kardiomyocytt-fysiologi. Foreløpig er rottemodellen for hjertesvikt etter infarkt fortsatt gullstandarden for å undersøke cellulære mekanismer for sykdomsprogresjon.
Humant vev er også tilgjengelig fra hjerter eksplantert under transplantasjonskirurgi, men tilgjengeligheten av kontrollhjerter er ekstremt begrenset. I tillegg får man ved slik bruk bare innsikt i sluttstadiet av sykdommen i menneskelige hjerter, ikke tidligere stadier av sykdomsprogresjon.
Noen dyr i del A viste tegn på smerte som krevde behandling med analgetika etter operasjon, utover den forventede behandlingsperioden. Dyr som viste tegn på infeksjon eller dekompensert hjertesvikt ble avlivet i henhold til angitte humane endepunkter.
101 rotter i del A, som hadde gjennomgått infarktoperasjoner men ikke kateterisering og undersøkelse med Accusampler, ble registrert som betydelig belastende i 2019 og 2020. Infarktkirurgi alene skulle kun vært registrert som moderat belastende, slik det var planlagt i den opprinnelige søknaden, og slik det ble observert og vurdert klinisk.
613 dyr ble brukt.
Totalt 48 dyr benyttet til del B er rapportert som betydelig belastende i årsrapporter i 2019 og 2020. Vurderingen var basert på kliniske observasjoner og den kumulative belastning fra 2 prosedyrer: 1) katerisering av a. carotis, og 2) kirurgisk inngrep for etablering av myokardielt infarkt og tilkobling til Accusampler.
Basert på kliniske observasjoner har forsøksmedarbeiderne vurdert at prosedyrene i del B var betydelig belastende i opptil 48 timer for disse dyrene.
Forskergruppen brukte 15 % færre dyr enn forventet (612 i stedet for 732 dyr). Dette ble muliggjort med ansettelse av en ekstra PhD-student som utførte parallelle eksperimenter på celler fra post-infarkt- dyr. Dermed ble det oppnådd flere celleopptak fra hvert dyr enn planlagt.
Forsøksansvarlig angir at det ikke er trolig at belastningen på dyrene kunne vært ytterligere redusert. Dyrehelsen ble regelmessig overvåket, spesielt hos dyr etter operasjon. Dyr som opplevde smerte ble raskt behandlet.
For del B er intermitterende tilkobling i forbindelse med uttak av blodprøve fra sampling button i nakken en mulighet. Dette vil være mindre belastende for dyrene, men manuelt uttak av blodprøve vil påvirke serum kortikosteron, og er derfor uheldig for dette formålet.
Forsøksansvarlig angir at de to humane endepunktene, sårinfeksjon og dekompensert hjertesvikt, var hensiktsmessige, og at forsøksmedarbeiderne effektivt kunne identifisere dyr som nærmet seg en uakseptabel belastning.