Preventing brain metastases by stabilizing the blood-brain barrier
Background
Malignant brain tumors are associated with poor patient prognosis, and current treatments are not effective. To study brain metastases, appropriate preclinical models are needed. We have established unique animal models for studying metastatic progression, either by injecting human metastatic tumor cells into the left cardiac ventricle of immunodeficient mice, or by injecting the same cells subcutaneously into nod/scid mice. We will now study how the blood-brain barrier (BBB) affects the metastatic properties of tumor development in the brain.
We aim to study whether a vascular destabilization of the BBB is a prerequisite for successful formation of brain metastases. If so, is a strategy where stabilization of the BBB is performed, sufficient to prevent formation of brain metastases.
Expected harm to animals
The compound that we want to test on the mice (AKB-9785), do not cause any harm to the animals, as shown previously in animal studies. Injections and imaging is causing mild harm to the animals, while tumor growth in the brain will cause moderate harm to the animals.
Expected benefit for science and society
We hope to achieve an improved treatment of patients with brain metastases.
How many and kind of animals to be used
116 + 72 nod/scid mice.
How the demand on RRR is to be achieved
We need to use animal models in our research, as in vitro models do not reflect the 3D structural behavior and physiological conditions in animals, and these conditions are crucial for intracranial tumor growth. Therefore, in vitro experiments are not sufficient to obtain our aim, which is to bring new treatment into the clinic.
Refinement: The injection techniques used, is causing mild harm to the animals. We use 2 trained people during the injections, one responsible for the injections, and the other responsible for animal care. The animals are placed onto a heating pad, and we use ultrasound guidance during intracardiac injections, which ensure fast and accurate injections. During imaging, two trained persons are present, one to prepare and monitor the animals, and the other to operate the imaging instrumentation. Heating is used. The imaging procedures do not cause any harm to the animals.
Regarding tumor development; the animals are monitored daily by trained people, and weighed twice/week. Regular imaging as described is important, as this will reveal tumor burden before detecting any symptoms in animal behavior. The last two weeks before sacrifice, the animals show progressive signs of discomfort, and analgetics will be considered.
Reduction: We are using ultrasound-guided injections of tumor cells into the left cardiac ventricle of the mice, which increases our success rate from previous 80% (when we did free-hand injections) to 100%. Thus, we can cut down the number of animals in each experimental group with 2 animals (from 14 to 12 animals).
Malignant brain tumors are associated with poor patient prognosis, and current treatments are not effective. To study brain metastases, appropriate preclinical models are needed. We have established unique animal models for studying metastatic progression, either by injecting human metastatic tumor cells into the left cardiac ventricle of immunodeficient mice, or by injecting the same cells subcutaneously into nod/scid mice. We will now study how the blood-brain barrier (BBB) affects the metastatic properties of tumor development in the brain.
We aim to study whether a vascular destabilization of the BBB is a prerequisite for successful formation of brain metastases. If so, is a strategy where stabilization of the BBB is performed, sufficient to prevent formation of brain metastases.
Expected harm to animals
The compound that we want to test on the mice (AKB-9785), do not cause any harm to the animals, as shown previously in animal studies. Injections and imaging is causing mild harm to the animals, while tumor growth in the brain will cause moderate harm to the animals.
Expected benefit for science and society
We hope to achieve an improved treatment of patients with brain metastases.
How many and kind of animals to be used
116 + 72 nod/scid mice.
How the demand on RRR is to be achieved
We need to use animal models in our research, as in vitro models do not reflect the 3D structural behavior and physiological conditions in animals, and these conditions are crucial for intracranial tumor growth. Therefore, in vitro experiments are not sufficient to obtain our aim, which is to bring new treatment into the clinic.
Refinement: The injection techniques used, is causing mild harm to the animals. We use 2 trained people during the injections, one responsible for the injections, and the other responsible for animal care. The animals are placed onto a heating pad, and we use ultrasound guidance during intracardiac injections, which ensure fast and accurate injections. During imaging, two trained persons are present, one to prepare and monitor the animals, and the other to operate the imaging instrumentation. Heating is used. The imaging procedures do not cause any harm to the animals.
Regarding tumor development; the animals are monitored daily by trained people, and weighed twice/week. Regular imaging as described is important, as this will reveal tumor burden before detecting any symptoms in animal behavior. The last two weeks before sacrifice, the animals show progressive signs of discomfort, and analgetics will be considered.
Reduction: We are using ultrasound-guided injections of tumor cells into the left cardiac ventricle of the mice, which increases our success rate from previous 80% (when we did free-hand injections) to 100%. Thus, we can cut down the number of animals in each experimental group with 2 animals (from 14 to 12 animals).
Etterevaluering
Grunnet bruk av intrakardiell injeksjon klassifiseres forsøket som betydelig belastende, jf. forsøksdyrforskriftens § 14 og vedlegg B.
Søker skal innen 1/6-2020 sende inn dokumentasjon som gjør det mulig for Mattilsynet å evaluere om forsøkets formål ble nådd.
Søker skal innen 1/6-2020 sende inn dokumentasjon som gjør det mulig for Mattilsynet å evaluere om forsøkets formål ble nådd.
Begrunnelse for etterevalueringen
Spredning av kreft til hjernen (hjernemetastaser) er assosiert med en meget dårlig pasientprognose, og dagens behandlingsalternativer er ikke effektive. Det er derfor behov for nye dyremodeller for å studere utviklingen av ondartet hjernekreft. De forsøksansvarlige har etablert unike dyremodeller for å studere tumorprogresjon: de injiserer humane hjernemetastase-celler inn i venstre hjerteventrikkel i immundefekte mus, og studerer deretter spredning til andre organer, inkludert hjernen. Blod-hjerne barrieren (BBB) er en essensiell barriere i hjernen, og kreftceller som sirkulerer i blodet, må bryte BBB for å trenge inn i hjernen og etablere svulster.
Liganden Angopoietin-2 (Ang-2) er et molekyl på endotelcellene i BBB som tidligere er vist å spille en rolle i permeabiliseringen av BBB, og derved i metastaseringsprosessen. De forsøksansvarlige har i et internasjonalt samarbeid studert om vaskulær destabilisering av BBB er nødvendig for at kreftsvulster skal kunne etablere seg i hjernen, og om man kan benytte farmakologiske inhibitorer (Tie2-agonister) for å blokkere eller begrense hjernemetastaseringen.
Forsøksdyrene ble behandlet med en Ang1/2 inhibitor og det ble vist at BBB ble permeabilisert, Forsøkene viste at antall hjernemetastaser minsket, dette ble verifisert v.h.a immunohistokjemi.
Målet med forsøket ble derved oppnådd.
Avbildningsforsøkene ble det kuttet ned på, da de forsøksansvarlige mente å kunne få gode resultater med mindre imaging. Opprinnelig beskrevet var MR-imaging i ukene 2, 4, 6 og 8, og PET/CT i ukene 3 og 7. Det ble foretatt bare MR i ukene 3, 4 og 6. Dette reduserte antall ganger i anestesi for dyrene, noe som kan ha bidratt til bedre velferd. Det ble tatt prescan, T1 vektet og T2 vektet MR sekvenser, total scantid (og derved i anestesi) var mindre enn 30 minutter pr dyr. Under selve scanningen var to personer alltid til stede fra forskningsgruppen, en person kjørte scanneren, og en person monitorerte dyrene.
Forsøket ble godkjent for bruk av 116 mus.
De forsøksansvarlige oppnådde tidlig de resultatene de forventet, og brukte derfor 48 mus i forsøk.
En viktig årsak til at forsøket ble klassifisert som betydelig belastende var bruk av intrakardielle injeksjoner.
Injeksjonene gjøres i totalanestesi med bruk av ultralyd-guiding. Det betyr at man kan følge nålens vei til venstre hjerteventrikkel hele veien. I tillegg kan man monitorere hjertebevegelsene og hjertets kontraksjonsfrekvens og se at dette ikke endres som følge av prosedyren.
Etablering av ultralyd-guidete injeksjoner har økt suksessraten for injeksjonene fra 80% til 100%. Dette har gjort at antall dyr i de eksperimentelle gruppene har kunnet reduseres.
Forsøksansvarlig beskriver god erfaring med prosedyren med hensyn til dyrevelferd. Rutinene er veletablerte, og det er alltid en person tilstede som har som eneste oppgave å følge opp dyrene etter injeksjonene.
Behandlingen med testsubstans ble administrert ved bruk av intraperitoneale injeksjoner. Musene har tålt behandlingen godt.
Musene har blitt fulgt opp tett gjennom forsøksperioden.
Erfaringene fra denne type forsøk viser at musenes velferd er god med tumorutvikling i hjernen over 4-5 uker. Etter denne perioden kan belastningen bli større.
Forsøksansvarlig beskriver MR-funn og vektutvikling som de sikreste kriteriene for vurdering av dyrenes velferd. Det er derfor riktig å legge mest vekt på disse kriteriene ved utforming av scoreskjema.
Mattilsynet har i tiden etter godkjenningen av FOTS id 12828 diskutert den egentlige belastningsgraden i slike forsøk, og har kommet frem til at selve de intrakardielle injeksjonene, gjennomført slik de gjøres i dette forsøket, ikke i seg selv automatisk bør gi forsøkene klassifiseringen betydelig belastende.
Vi er enige med forsøksansvarliges vurdering av belastningsgraden i FOTS id 12828 som moderat.
Liganden Angopoietin-2 (Ang-2) er et molekyl på endotelcellene i BBB som tidligere er vist å spille en rolle i permeabiliseringen av BBB, og derved i metastaseringsprosessen. De forsøksansvarlige har i et internasjonalt samarbeid studert om vaskulær destabilisering av BBB er nødvendig for at kreftsvulster skal kunne etablere seg i hjernen, og om man kan benytte farmakologiske inhibitorer (Tie2-agonister) for å blokkere eller begrense hjernemetastaseringen.
Forsøksdyrene ble behandlet med en Ang1/2 inhibitor og det ble vist at BBB ble permeabilisert, Forsøkene viste at antall hjernemetastaser minsket, dette ble verifisert v.h.a immunohistokjemi.
Målet med forsøket ble derved oppnådd.
Avbildningsforsøkene ble det kuttet ned på, da de forsøksansvarlige mente å kunne få gode resultater med mindre imaging. Opprinnelig beskrevet var MR-imaging i ukene 2, 4, 6 og 8, og PET/CT i ukene 3 og 7. Det ble foretatt bare MR i ukene 3, 4 og 6. Dette reduserte antall ganger i anestesi for dyrene, noe som kan ha bidratt til bedre velferd. Det ble tatt prescan, T1 vektet og T2 vektet MR sekvenser, total scantid (og derved i anestesi) var mindre enn 30 minutter pr dyr. Under selve scanningen var to personer alltid til stede fra forskningsgruppen, en person kjørte scanneren, og en person monitorerte dyrene.
Forsøket ble godkjent for bruk av 116 mus.
De forsøksansvarlige oppnådde tidlig de resultatene de forventet, og brukte derfor 48 mus i forsøk.
En viktig årsak til at forsøket ble klassifisert som betydelig belastende var bruk av intrakardielle injeksjoner.
Injeksjonene gjøres i totalanestesi med bruk av ultralyd-guiding. Det betyr at man kan følge nålens vei til venstre hjerteventrikkel hele veien. I tillegg kan man monitorere hjertebevegelsene og hjertets kontraksjonsfrekvens og se at dette ikke endres som følge av prosedyren.
Etablering av ultralyd-guidete injeksjoner har økt suksessraten for injeksjonene fra 80% til 100%. Dette har gjort at antall dyr i de eksperimentelle gruppene har kunnet reduseres.
Forsøksansvarlig beskriver god erfaring med prosedyren med hensyn til dyrevelferd. Rutinene er veletablerte, og det er alltid en person tilstede som har som eneste oppgave å følge opp dyrene etter injeksjonene.
Behandlingen med testsubstans ble administrert ved bruk av intraperitoneale injeksjoner. Musene har tålt behandlingen godt.
Musene har blitt fulgt opp tett gjennom forsøksperioden.
Erfaringene fra denne type forsøk viser at musenes velferd er god med tumorutvikling i hjernen over 4-5 uker. Etter denne perioden kan belastningen bli større.
Forsøksansvarlig beskriver MR-funn og vektutvikling som de sikreste kriteriene for vurdering av dyrenes velferd. Det er derfor riktig å legge mest vekt på disse kriteriene ved utforming av scoreskjema.
Mattilsynet har i tiden etter godkjenningen av FOTS id 12828 diskutert den egentlige belastningsgraden i slike forsøk, og har kommet frem til at selve de intrakardielle injeksjonene, gjennomført slik de gjøres i dette forsøket, ikke i seg selv automatisk bør gi forsøkene klassifiseringen betydelig belastende.
Vi er enige med forsøksansvarliges vurdering av belastningsgraden i FOTS id 12828 som moderat.