Geneditering av gener involvert i pigmentering ved injeksjon av CRISRP/Cas9 i befruktede lakseegg (copy)
Til tross for økt tilsetning av relativt kostbart astaxanthin til fôret i norsk kommersielt lakseoppdrett de siste årene, har man observert problemer med pigmentering, både jevnt over en bleikere laksefilet og områder av filet med ujevn innfarging. Dette betyr at man ikke fullt ut kan forbedre innfarging av laksemuskel ved å øke innholdet av astaxanthin i fôret.
Formålet med dette forsøket er å undersøke funksjonen til sentrale gener knyttet til opptak og metabolisme av astaxantin i laks. Økt kunnskap om gener som påvirker deponering av astaxantin vil kunne bidra til å bedre pigmentering av oppdrettet laksefilet. Kunnskapen vil kunne implementeres i avlsprogrammet av laks og evt i fôringsstrategier.
Vi vil slå ut aktuelle gener involvert i astaxantin opptak og metabolisme i befruktede lakseegg basert på CRISPR/Cas9 teknologi og studere konsekvensene av et ikke-funksjonelt gen. Befruktede lakseegg vil bli injisert CRISPR/Cas9 og deretter fulgt tett fram mot ca 1500g. Suksessraten ved en slik injisering er på ca. 15% (personlig kommunikasjon, Rolf Edvardsen, Havforskningsinstituttet). Totalt vil vi benytte 4500 egg til forsøket.
De aktuelle genene (srb1, bco2 og arf4like) er selektert fra et stort antall transkripsjonsanalyser (microarray) knyttet til pigmentering i laks. Hypotesen vår er at disse genene er knyttet til astaxanthin opptak og metabolisme, og resultatet av en genredigering og et ikke funksjonelt protein kan være endret pigmentering. Fra studier på mus vet vi at genetisk knockout av Scavenger Receptor Class B Member (srb1) øker at sirkulerende HDL‐C og hemmer sekresjon av kolesterol i faeces. Knock out av Beta-Carotene Oxygenase 2 (bco2) i mus viste ingen effekt på matinntak eller vekt, men hemmet APO10ol produksjon (Amengula 2013). Studier i mus har vist at ADP ribosyleringsfaktor 4 (arf4) er essensielll for embryoutvikling. Laks har imidlertid 4 isoformer av arf4, og vi vil undersøke en av isoformene, arf4like.
Det er ingen studier på hvordan ikke-funksjonelle arf4like, srb1 og bco2 påvirker laksen, men vil bli studert i dette forsøket. Det er ikke forventet at genredigeringen gir redusert fiskevelferd.
Dersom enkelte aspekter ved funksjonen til disse genene eller metodikk kan studeres ved bruk av in vitro cellekultur, vil vi benytte isolerte primære hepatocytter og muskelceller eller cellelinjer fra laks. Primærceller kan imidlertid ikke erstatte fiskeforsøkene fullstendig fordi vi ønsker å se hvordan genene påvirker opptak og metabolisme i laks og metabolismen er et samspill mellom flere organer, blant annet tarm, lever og muskel. Vi vil sikre så mye prøvemateriale som mulig fra forsøksfisken for bruk til ulike analyser (genuttrykk, histologi, pigmentanalyser) slik at vi ved dette forsøket får mest mulig kunnskap om funksjonen av genene i laks.
Formålet med dette forsøket er å undersøke funksjonen til sentrale gener knyttet til opptak og metabolisme av astaxantin i laks. Økt kunnskap om gener som påvirker deponering av astaxantin vil kunne bidra til å bedre pigmentering av oppdrettet laksefilet. Kunnskapen vil kunne implementeres i avlsprogrammet av laks og evt i fôringsstrategier.
Vi vil slå ut aktuelle gener involvert i astaxantin opptak og metabolisme i befruktede lakseegg basert på CRISPR/Cas9 teknologi og studere konsekvensene av et ikke-funksjonelt gen. Befruktede lakseegg vil bli injisert CRISPR/Cas9 og deretter fulgt tett fram mot ca 1500g. Suksessraten ved en slik injisering er på ca. 15% (personlig kommunikasjon, Rolf Edvardsen, Havforskningsinstituttet). Totalt vil vi benytte 4500 egg til forsøket.
De aktuelle genene (srb1, bco2 og arf4like) er selektert fra et stort antall transkripsjonsanalyser (microarray) knyttet til pigmentering i laks. Hypotesen vår er at disse genene er knyttet til astaxanthin opptak og metabolisme, og resultatet av en genredigering og et ikke funksjonelt protein kan være endret pigmentering. Fra studier på mus vet vi at genetisk knockout av Scavenger Receptor Class B Member (srb1) øker at sirkulerende HDL‐C og hemmer sekresjon av kolesterol i faeces. Knock out av Beta-Carotene Oxygenase 2 (bco2) i mus viste ingen effekt på matinntak eller vekt, men hemmet APO10ol produksjon (Amengula 2013). Studier i mus har vist at ADP ribosyleringsfaktor 4 (arf4) er essensielll for embryoutvikling. Laks har imidlertid 4 isoformer av arf4, og vi vil undersøke en av isoformene, arf4like.
Det er ingen studier på hvordan ikke-funksjonelle arf4like, srb1 og bco2 påvirker laksen, men vil bli studert i dette forsøket. Det er ikke forventet at genredigeringen gir redusert fiskevelferd.
Dersom enkelte aspekter ved funksjonen til disse genene eller metodikk kan studeres ved bruk av in vitro cellekultur, vil vi benytte isolerte primære hepatocytter og muskelceller eller cellelinjer fra laks. Primærceller kan imidlertid ikke erstatte fiskeforsøkene fullstendig fordi vi ønsker å se hvordan genene påvirker opptak og metabolisme i laks og metabolismen er et samspill mellom flere organer, blant annet tarm, lever og muskel. Vi vil sikre så mye prøvemateriale som mulig fra forsøksfisken for bruk til ulike analyser (genuttrykk, histologi, pigmentanalyser) slik at vi ved dette forsøket får mest mulig kunnskap om funksjonen av genene i laks.